Exiqon microRNA PCR芯片

  • 简介
  • 产品特点
  • 实验流程
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  • SCI成果
  •        Exiqon miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR芯片检测平台,基于LNA?专利技术,采用独特的Universal RT反应,实现对microRNA的准确定量检测,即使在总RNA含量较低的样本,如FFPE和血清/血浆中,也可以获得高质量的microRNA检测结果。

    康成生物为您提供Exiqon公司miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR芯片——microRNA实时定量PCR芯片技术服务,全部实验皆使用进口试剂完成,使用的定量PCR仪器为美国应用生物系统公司生产的荧光定量PCR仪ABI PRISM? 7700或ABI PRISM? 7900。PCR芯片技术服务的主要流程包括:抽提、RNA质量检测、cDNA模板制备、实时定量PCR、数据处理及制作实验报告。

    Exiqon miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR芯片列表


    芯片名称 规格 物种 描述
    microRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I 384 well 372个常见的人类miRNA
    microRNA Ready-to-Use PCR, Human panel I+II 384 well 752 个人类miRNA
    microRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel I 384 well 小鼠,大鼠 372个常见的小鼠/大鼠miRNA
    microRNA Ready-to-Use PCR, Mouse&Rat panel I+II 384 well 小鼠,大鼠 752 个小鼠/大鼠miRNA
    Cancer Focus microRNA PCR Panel 96 well 84个癌症相关的miRNA
    Serum/Plasma Focus microRNA PCR Panel 384 well 179个在血清、血浆样品中验证过的miRNA
    Stem Cell Focus microRNA PCR Panel 96 well 85个与胚胎干细胞或多能诱导干细胞相关的miRNA


    Exiqon的LNA?专利技术攻破MicroRNA PCR检测的两大难题

    1. LNA?化学修饰提高引物和靶标分子的结合力,提高检测灵敏度,解决microRNA引物设计的难点:

           microRNA长度仅22nt左右,相当于一条普通oligo引物的长度,而PCR扩增需要上下游两条引物,因此传统的microRNA的PCR方法仅一条引物为microRNA特异性,另一条采用通用引物,检测的特异性降低。 此外,microRNA的GC含量分布范围广: 5%-95%,由于A :T配对碱基的结合力要低于G :C配对,此GC含量低于50%的microRNA,即使整条序列都被一条普通的oligo引物覆盖,该引物的Tm值参数仍然难以达到PCR检测的要求(55-63℃),这个部分的microRNA用普通引物是不能得到有效扩增。LNA?专利技术能解决microRNA研究的难点,包括PCR检测。每个LNA?修饰位点能够提高引物Tm值3-8℃,因此在相同的PCR反应条件下(引物的Tm值60℃左右),可以通过加入LNA?缩短引物的长度,使得上下游都为microRNA特异性引物,PCR的特异性得到双重保障。而且更为重要的是,GC含量低的microRNA的PCR问题也能迎刃而解,控制加入LNA?的比例(GC含量低的microRNA检测引物加入多个LNA?修饰的碱基),使所有的microRNA都能得到有效的、均一的检测信号。

    图1.左图为LNA?(Locked Nucleic Acid)的化学结构,LNA是一种类寡核苷酸衍生物,提高引物和靶标分子的稳定性,能够增加引物的溶解温度(Tm值)。相同的Tm参数条件下,加入LNA可以缩短引物长度(右图)。


    2. LNA?专利技术显著提高PCR反应的单碱基分辨能力,区分MicroRNA家族各成员:

           microRNA中存在多个家族(microRNA family),家族成员间序列相似性极高,个别成员间仅相差一个碱基。普通oligo引物无法分辨单碱基差异,即使有一个碱基错配也能继续PCR反应,因此无法分辨极度相似的家族成员。LNA?修饰的引物具有单碱基分辨能力,其原理如下图所示。ΔTm=Tm(引物/完美匹配的靶标分子)-Tm(引物/单碱基错配靶标分子),加入LNA?后ΔTm值显著增加,PCR交叉反应的可能性大大降低。Tm(LNA引物/单碱基错配)低于PCR反应温度,PCR反应条件下引物和错配分子处于解离单链状态不能进行PCR反应;Tm(LNA引物/完美匹配靶标分子)高于60℃,产生有效的PCR扩增信号。


    图2.左图加入LNA?后ΔTm值显著增加,PCR交叉反应的可能性大大降低。右图,人工合成序列相似的microRNA成员分子,用miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR平台检测。如表所示,交叉反应的信号极低,有些情况下甚至没有。  





  • Exiqon miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR芯片特点

    1.灵敏度高:

           微量样本,无需预扩增,节省宝贵样本;对RNA量低的样本,如血清、血浆、FFPE、LCM等特殊样本尤其适用;LNA? PCR系统检测单个microRNA仅需1pg总RNA(图3);而miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR芯片在仅仅40ng总RNA中就可以检测730种microRNA的表达;LNATM PCR芯片灵敏度是同类芯片的10倍以上。

    2.特异性强:

           经LNATM 优化的PCR引物,可有效区分microRNA间的单碱基差异,并能区分成熟和前体microRNA;同时使背景信号值最??;

    3.准确性高:

           LNATM PCR芯片上的引物均经过了实验验证;反转录采用Universal RT对各种不同的microRNA同时进行反转录,减少技术误差;对AT含量高的microRNA同样有效。

    4.质控严格:

           每个panel均包含6个内参和2组质控对照;基于SYBR green的PCR方法,还可以提供溶解曲线以判断扩增特异性(图4)
    5.高重复性:

           简化实验步骤,减少技术误差,实验重复性好(图5)


    Exiqon miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR 芯片如何实现高通量高质量的microRNA定量检测?

    1.独特的Universal RT反应:
           一次单链cDNA合成反应制备的cDNA可作为芯片所有microRNA PCR反应的模板(图6),减少操作步骤,消除技术误差,节省宝贵样本。同时避免了在芯片中使用混合RT引物对扩增特异性的影响。

    图6. Universal RT microRNA PCR反应原理


    2.基于LNA?专利技术的PCR扩增反应:
           实现引物Tm值均一,并同时保持microRNA扩增的高特异性和高灵敏度:
           miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR芯片中所使用的microRNA特异性的PCR引物(PCR扩增上下游引物)都经过LNA?优化,并且经过严格的验证,能有效区分序列只差一个碱基的microRNA,并能区别成熟microRNA和microRNA前体,从而保证对靶microRNA的特异性扩增;同时,显著降低背景信号,从而增强对低丰度microRNA的准确检测。

    3.严格的芯片内参照和质控设置:
           miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR芯片内设置了6个内参,包括:3个microRNA (hsa-miR-103, hsa-miR-191 and hsa-miR-423-5p),3个小RNA (U6, SNORD38B and SNORD49A)。这些内参在大量实验结果和多种组织的microRNA表达分析中均呈现出稳定的表达水平,但研究者也需要根据组织或细胞的实际情况选择最合适的、稳定表达的内参分析试验结果。
           同时,芯片内还设置了一个spike-in对照和一组3次重复的芯片间误差校正参照。


    Exiqon miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR芯片应用

    1. miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR芯片在LCM微量样本microRNA表达检测中的应用:
           由于miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR芯片要求的样本量较其他平台更少,对于LCM等微量样本尤其适用。(图7)


    2. miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR芯片在血清/血浆的microRNA检测中的应用:

           近年来,microRNA成为来源于血液来源的新生物学标记物,但由于采血量和microRNA分子大小及表达水平等限制,检测血液中的microRNA面临着诸多挑战。

           miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR芯片具有无与伦比的灵敏度和检测特异性,即使对血清/血浆等含微量总RNA的样本,也可实现对microRNA的高质量检测;并且无需对cDNA进行预扩增。(图8)





  • 1.样品RNA抽提

           a.实验对象为组织样品,取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品,使用BioPulverizerTM冰冻粉碎组织,加1ml的RNA抽提试剂TRIzol(Invitrogen),使用Mini-Bead-Beater-16匀浆后抽提RNA。

           b.实验对象为细胞样品,每份样品取1×106~1×107细胞,加1ml的RNA抽提试剂TRIzol(样品为贴壁细胞,每10cm2培养皿TRIzol使用量为1ml),裂解后抽提RNA。

    2.RNA质量检测

           a.使用Nanodrop测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值,以计算浓度并评估纯度。

           b.用甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳,检测RNA纯度及完整性。

           c.提供RNA QC报告。

    3.cDNA合成

           按照Exiqon逆转录试剂盒使用说明将样品RNA逆转录为cDNA。

    4.实时定量PCR

           按照芯片说明将cDNA模板适当稀释后加入到实时定量PCR反应混合液中,然后再含有基因特异性引物的96孔板各孔中加入等量反应液,进行实时定量PCR反应。

    5.数据分析

           利用配套软件计算PCR芯片中的各个miRNA的Ct值,采用公认的DDCt方法比较基因的表达变化。

           a.计算每个处理组中的每个miRNA ΔCt。

           ΔCt (Ctrl) = average Ct – average of HK genes’ Ct for Ctrl array

           ΔCt (Exp) = average Ct – average of HK genes’ Ct for Exp array

           b.计算2个PCR Array中每个基因的ΔΔCt。

           ΔΔCt = ΔCt (Exp) - ΔCt (Ctrl)

           c.通过2-ΔΔCt计算Exp(实验组)与Ctrl(对照组)间基因的表达差异。

    6.提供实验报告

           MiRNA table(miRNA列表)
           Excel芯片结果汇总表(包括芯片原始结果、数据分析和各种图表)




  • 1.分子标志物筛选

    结肠癌分型marker(Identification of serum microRNA profiles in colon cancer. BJC.2013)

    使用芯片:Exiqon miRCURY LNA? Universal RT microRNA PCR Panel
           研究者通过比较:1)结肠癌和健康对照,2)早期和晚期结肠癌病人的血清microRNA表达,筛选得到了可以作为早期诊断标记物的21个microRNA。这些microRNA中的一部分与结肠癌组织和细胞水平的研究得到的microRNA有重叠,另外一部分则是在其他癌症中发现的重要的microRNA。由于microRNA的调控是一个复杂的网络,所以采用一组而不是某一个microRNA作为分子标记物会更加可靠?;诖搜芯砍晒?,还将在更多的临床样本,不同种族的群体中进行microRNA标志物的验证。




    2.功能机制研究

    High dose glargine alters the expression profiles of microRNAs in pancreatic cancer cell, 2012, WJG)
           甘精胰岛素(glargine)是临床上用于糖尿病治疗的药物,但与胰腺癌的患病风险风险提高有关,本研究从microRNA分子水平揭示其促癌的分子机制。首先应用Exiqon microRNA Ready- to- use human Panel I检测甘精胰岛素刺激下胰腺癌细胞(SW1990)的microRNA表达谱变化,筛选得到12个表达变化的microRNA其中miR-95的变化倍数最高。而后围绕着miR-95展开的细胞以及动物模型的实验并证明miR-95具有促进癌细胞增殖、转移,以及肿瘤组织生长的作用。




  • → Mir-449a, a potential diagnostic biomarker for WNT group of medulloblastoma. J NEURO-ONCOL. 2016

    → MiR-28-3p as a potential plasma marker in diagnosis of pulmonary embolism. Thromb Res. 2015

    → Diagnostic value of a plasma microRNA signature in gastric cancer: a microRNA expression analysis. Sci Rep. 2015

    → Identification of Differential MicroRNAs in Cerebrospinal Fluid and Serum of Patients with Major Depressive Disorder. PLoS One. 2015

    → Plasma miR-122 and miR-192 as potential novel biomarkers for the early detection of distant metastasis of gastric cancer. Oncol Rep. 2014

    → Aberrant miRNA profiles associated with chronic benzene poisoning. Exp Mol Pathol. 2014  

    → Serum miR-19a Predicts Resistance to FOLFOX Chemotherapy in Advanced Colorectal Cancer Cases. Asian Pacific journal of cancer prevention. 2013

    → High dose glargine alters the expression profiles of microRNAs in pancreatic cancer cells. World Journal of Gastroenterology. 2012

    → Metformin alters the expression profiles of microRNAs in human pancreatic cancer cells. diabetes research and clinical practice. 2012