Cancer Research: Arraystar lncRNA芯片用于卵巢癌研究

       四川大学华西医院周圣涛教授擅长肿瘤、子宫肌瘤以及子宫内膜异位等良恶性妇科疾病的诊断和治疗。近期,该课题组应用美国Arraystar LncRNA芯片分析了趋化因子CXCL14介导的卵巢癌细胞中长链非编码RNAs(lncRNAs)的表达情况,筛选到大量异常表达的lncRNAs,并且对其中的LINC00092的机制进行了深入研究。该研究成果于2017年发表在国际著名学术期刊Cancer Research(IF:8.556)上。(芯片实验由康成生物提供技术服务)


研究背景

      卵巢癌是妇科疾病中比较常见的恶性肿瘤,据报道年发病率在0.03-0.12‰。因为该疾病在早期缺乏特异性症状,大多数患者被诊断时已经处于肿瘤晚期。作者前期研究表明卵巢癌相关的成纤维细胞(CAFs)可以促进卵巢癌的发生和发展,并且CAFs中趋化因子CXCL14的表达量相对于正常卵巢成纤维细胞(NAFs)明显升高。接着,作者做了一系列的实验证明CAFs是通过CXCL14来促进卵巢癌的发生和发展的。但是,CXCL14促进卵巢癌发生的作用机制仍是未知。

研究表明lncRNAs在卵巢癌的发生和发展中发挥着重要作用,但是没有直接证据表明CAFs促进卵巢癌发生的过程中lncRNA是否发挥功能。因此,作者对于CAFs分泌的CXCL14是否是通过诱导下游lncRNA表达水平的改变来促进卵巢癌的发生进行了探究。


研究思路

       为了探究CXCL14异常表达促进卵巢癌的发生中lncRNAs的表达水平是否发生变化,作者构建了CXCL14突变的细胞模型,并且借助美国Arraystar Human lncRNA array检测了CXCL14突变株和野生型细胞中lncRNAs的表达情况。根据芯片结果,作者选取了上调最显著的5个lncRNA分子(RP11-119F7.5, ZEB1-AS1, XLOC_000493, RP11-12L2.4, and LINC00092)进行功能验证(Loss of Function),发现只有LINC00092的表达水平发生变化会影响卵巢癌细胞的迁移能力。因此,作者就将LINC00092作为CXCL14调控癌细胞发生和发展的下游靶基因做了进一步探究。

接着,作者又设计了针对LINC00092的siRNA来验证该分子在卵巢癌代谢中的功能。实验发现,LINC00092表达水平的降低会显著抑制癌细胞的侵袭能力,增加细胞凋亡。同时,作者还发现过表达LINC00092可以回补沉默CXCL14所导致的生物学功能。

       糖酵解过程在肿瘤发生和癌症发展中起到重要的作用,并且已有多篇文献报道lncRNA可以通过多种机制来调控糖酵解,因此作者探究LINC00092是否也是通过调控糖酵解过程来促进卵巢癌的发生。实验发现敲除LINC00092会使得癌细胞内很多代谢产物的含量明显降低,尤其是乳酸的含量变化最为明显。上述实验表明LINC00092可以改变卵巢癌细胞代谢过程中的糖酵解水平。然后,作者开始研究LINC00092在改变糖酵解过程中是如何发挥功能的。借助RT-PCR和RNA pull down实验,作者找到了LINC00092的靶基因果糖-2,6-二磷酸酶2(PFKFB2),并且进一步分析发现LINC00092和PFKFB2的表达水平呈正相关(r=0.52)。上述一系列实验也表明了LINC00092是通过结合PFKFB2来调控卵巢癌的发生和发展的。

       另外,作者验证了PFKFB2在卵巢癌发生发展中的功能,发现敲低PFKFB2显著降低癌细胞的迁移和侵袭能力,增加凋亡;同时,过表达PFKFB2可以回补由沉默LINC00092所导致的生物学功能。最后,作者证明CXCL14、LINC00092和PFKFB2在卵巢癌的代谢过程中是必不可少的三个分子。


技术路线


 


结果展示


图一 芯片及qPCR验证结果和KM曲线。左图:芯片筛选结果;中图:RT-PCR验证结果;右图:KM曲线


图二 LINC00092的功能验证(LOF)。左图:细胞侵袭实验;右图:细胞凋亡实验



图三 机制探究。左图:糖酵解过程关键酶的qPCR验证结果;右图:WB结果



研究意义

       本研究借助美国Arraystar Human LncRNA array在卵巢癌中筛选到大量异常表达的lncRNA,通过一系列的实验验证和临床分析发现LINC00092与卵巢癌的发生和发展具有紧密的联系。接着,作者对于LINC00092是如何调控卵巢癌的发生发展做了进一步探究。总之,本研究的芯片数据对卵巢癌的诊断和治疗,以及探究非编码RNA的分子机制奠定了基础。


原文出处

Long non-coding RNA LINC00092 acts in cancer-associated fibroblasts to drive glycolysis and progression of ovarian cancer. Cancer Research. 2017.