MeDIP-qPCR

  • 简介
  • 技术特点
  • 技术服务流程
  • 客户案例
  •       实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative PCR)是在PCR反应体系当中加入荧光试剂,利用荧光信号积累实时检测PCR的进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR能够专一,灵敏,快速,高重复地精确定量起始模板的浓度。
          康成生物将实时定量PCR技术与MeDIP技术完美结合。首先通过MeDIP技术富集甲基化的DNA片段,然后利用实时定量PCR技术进行检测,最后经过数据分析处理得到检测的生物样品中特定位点的甲基化水平的精确数值。

  • ? 高特异性,针对感兴趣的基因启动子或CpG岛设计实时定量PCR引物
    ? 超宽的线性范围,可跨越7个数量级
    ? 精确度高,重复性好
    ? 灵敏度高 

  • 实验流程

    A. 将基因组DNA 超声打断成400bp-500bp片段
    B. 加热变性,并将变性后的单链DNA样品分为两份
    C. 其中一份单链DNA样品加入抗5’-甲基胞嘧啶抗体,另一份作为Total input DNA样品
    D. 使用亲和层析分离C步样品中的甲基化DNA片段的抗体复合物,样品中其余的非甲基化DNA片段被洗脱。纯化得到甲基化DNA片段(MeDNA-IP DNA)
    E. 实时定量PCR检测 



    数据处理
    ?  Total input DNA样品作为模板,用待测基因特异性引物进行qPCR检测得到Ct (input)
    ?  MeDNA-IP DNA样品作为模板进行检测得到Ct (IP)
    ?  待测基因甲基化DNA免疫沉淀(MeDIP)的效率(MeDIP / Total input)可通过以下公式计算:
       %(MeDIP / Total input)= 2^[ Ct (input)- Ct (IP) ] X 100


  • Quantitative detection of multiple gene promoter hypermethylation in tumor tissue, serum, and cerebrospinal fluid predicts prognosis of malignant gliomas. Neuro Oncol., 2010.

           研究人员利用MeDIP-qPCR技术检测发现,在不同恶性神经胶质瘤病人的肿瘤组织,血清和脑脊髓液样本中,MGMT, p16INK4a, TIMP-3,和THBS1四个基因启动子区域都发生了高甲基化,而且血清和脑脊髓液的DNA甲基化水平与肿瘤组织基本一致(见下图)。通过与临床生存数据关联分析发现,MGMT, p16INK4a和THBS1的甲基化水平可以作为独立的预测因子用于肿瘤的预后分析。因此血清或脑脊液中这些基因的甲基化有望成为新的肿瘤标志物,同时检测这些基因的甲基化水平也为恶性胶质瘤病人的化疗方案选择和预后分析提供了新的理论依据。


    上图:MeDIP/Input值表示DNA甲基化水平的高低;圆圈代表不同的病人样本;黑色短线是有效区分病人预后好和差的甲基化阈值。